細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒

一，試劑盒組份

二，說明

在研究細(xì)胞時經(jīng)常要研究細(xì)胞的不同組份，而研究得zui多的兩個細(xì)胞組份就是細(xì)胞核和細(xì)胞漿。分離細(xì)胞核蛋白和細(xì)胞漿蛋白，不僅可以用于研究蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位，而且很多時候分離出來的核蛋白可以用于轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面的研究，例如EMSA（也稱gelshift），footprinting等。

細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒（Nuclear and Cytoplasmic Protein Extraction Kit）提供了一種比較簡單、方便的從培養(yǎng)細(xì)胞或新鮮組織中抽提細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白的方法。約90分鐘就可以完成培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白的分離。抽提得到的蛋白可以用于Western，EMSA，footprinting，報告基因檢測以及酶活力測定等后續(xù)操作。

本試劑盒是通過細(xì)胞漿蛋白抽提試劑A和B，在低滲透壓條件下，使細(xì)胞充分膨脹，然后破壞細(xì)胞膜，釋放出細(xì)胞漿蛋白，然后通過離心得到細(xì)胞核沉淀。zui后通過高鹽的細(xì)胞核蛋白抽提試劑抽提得到細(xì)胞核蛋白。

本試劑盒可以抽提50/200個樣品，每個樣品的數(shù)量為約二百萬細(xì)胞或約60毫克組織。

三，儲存條件：-20℃保存，一年有效。

四，操作步驟

1. 準(zhǔn)備溶液：溫融解試劑盒中的三種試劑，溶解后立即放置在冰上，混勻。取適當(dāng)量的細(xì)胞漿蛋白抽提試劑A備用，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使PMSF的zui終濃度為1mM。取適當(dāng)量的細(xì)胞核蛋白抽提試劑備用，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使PMSF的zui終濃度為1mM。
2. 對于貼壁細(xì)胞：用PBS洗一遍，用細(xì)胞刮子刮下細(xì)胞，或用EDTA溶液處理細(xì)胞使細(xì)胞不再貼壁很緊，并用移液器吹打下細(xì)胞。離心收集細(xì)胞，盡zui大努力吸盡上清，留下細(xì)胞沉淀備用。盡量避免用胰酶消化細(xì)胞，以免胰酶降解需抽提的目的蛋白。
3. 對于懸浮細(xì)胞：用PBS洗一遍，離心收集細(xì)胞，盡zui大努力吸盡上清，留下細(xì)胞沉淀備用。
4. 每20微升細(xì)胞沉淀加入200微升添加了PMSF的細(xì)胞漿蛋白抽提試劑A。（對于二百萬Hela細(xì)胞，其細(xì)胞沉淀的體積大約為20微升或40毫克。）
5. zui高速劇烈Vortex 5秒，把細(xì)胞沉淀*懸浮并分散開。（如果細(xì)胞沉淀沒有*懸浮并分散開，可以適當(dāng)延長vortex時間。）
6. 冰浴10-15分鐘。
7. 加入細(xì)胞漿蛋白抽提試劑B 10微升。zui高速劇烈Vortex 5秒，冰浴1分鐘。
8. zui高速劇烈Vortex 5秒，4℃ 12,000-16,000g離心5分鐘。
9. 立即吸取上清至一預(yù)冷的塑料管中，即為抽提得到的細(xì)胞漿蛋白?？梢粤⒓词褂茫部梢詢龃?。（千萬不要觸及沉淀，可以在沉淀上方保留極小體積的上清，以免觸及沉淀。）
10. 對于沉淀，*吸盡殘余的上清，加入50微升添加了PMSF的細(xì)胞核蛋白抽提試劑。（不吸盡上清會帶來細(xì)胞漿蛋白的污染。）
11. zui高速劇烈Vortex 15-30秒，把細(xì)胞沉淀*懸浮并分散開。然后放回冰浴中，每隔1-2分鐘再高速劇烈Vortex 15-30秒，共30分鐘。
12. 4℃ 12,000-16,000g離心10分鐘。
13. 立即吸取上清至一預(yù)冷的塑料管中，即為抽提得到的細(xì)胞核蛋白?？梢粤⒓词褂茫部梢?70℃凍存。
14. 對于新鮮組織：
    A. 把組織盡可能切成非常細(xì)小的碎片。按照20:1的比例混合適當(dāng)量的細(xì)胞漿蛋白抽提試劑A和B（例如200微升細(xì)胞漿蛋白抽提試劑A中加入10微升抽提試劑B）。并加入PMSF至zui終濃度為1mM配制成組織勻漿液。按照每60mg組織加入200微升組織勻漿液的比例混合組織和組織勻漿液，并在玻璃勻漿器內(nèi)充分勻漿。勻漿需在冰浴或4℃進(jìn)行。
    B. 勻漿后把勻漿液轉(zhuǎn)移到塑料離心管內(nèi)，冰浴放置15分鐘。
    C. 4℃ 1,500g離心5分鐘。把上清轉(zhuǎn)移至一預(yù)冷的塑料管中，為抽提得到的部分細(xì)胞漿蛋白。（吸上清時千萬不要觸及沉淀。）
    D. 對于沉淀，到了這一步已經(jīng)充分勻漿，但很多細(xì)胞還沒有破碎。接下去按照使用說明的步驟4開始操作，即把沉淀當(dāng)做已經(jīng)離心收集好的細(xì)胞沉淀操作，按照步驟4至步驟13抽提得到細(xì)胞漿蛋白和細(xì)胞核蛋白。抽提得到的細(xì)胞漿蛋白可以和步驟14C中抽提得到的細(xì)胞漿蛋白合并。

五，注意事項(xiàng)：

PMSF一定要在抽提試劑加入到樣品中前2-3分鐘內(nèi)加入，以免PMSF在水溶液中很快失效。

    抽提蛋白的所有步驟都需在冰上或4℃進(jìn)行。

    本試劑盒對于組織樣品，僅適合于新鮮組織，對凍存過的組織抽提效果很差。

    使用本試劑盒抽提到的細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白均可直接用我們生產(chǎn)的BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。但不適合用Bradford法測定蛋白濃度。

為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。