III 1st Strand cDNA Synthesis Kit 反轉錄
Script III 1st Strand cDNA Synthesis Kit（With dsDNase）采用第三代高效逆轉錄酶，具有更強的延伸能力和穩(wěn)定性，并配備了具有DNA分解活性的特殊dsDNase，只需一步操作， 即可同時完成基因組清除與逆轉錄反應，操作方便快捷III 1st Strand cDNA Synthesis Kit 反轉錄
Script III 1st Strand cDNA Synthesis Kit（With dsDNase）（for PCR or qPCR）
III 1st Strand cDNA Synthesis Kit 反轉錄
目錄號：71118
產品內容
Components | 71118-50 50 rxns (20 μl/rxn) | 71118-100 100 rxns (20 μl/rxn) |
5x TRUE Reaction Mix | 200 μl | 400 μl |
dsDNase | 50 μl | 100 μl |
Oligo(dT)18 (0.5 μg /μl) | 50 μl | 100 μl |
Random primer (N6) | 50 μl | 100 μ |
RNase free H2O | 1.5 m | 1.5 ml |
保存條件：-20℃保存，有效期 12 個月。
產品簡介
Script III 1st Strand cDNA Synthesis Kit（With dsDNase）采用第三代高效逆轉錄酶，具有更強的延伸能力和穩(wěn)定性，并配備了具有DNA分解活性的特殊dsDNase，只需一步操作， 即可同時完成基因組清除與逆轉錄反應，操作方便快捷，可用于長達12kb的cDNA合成以及高比例的全長cDNA文庫的構建等。逆轉錄產物可以用于PCR，克隆基因；也可以用于qPCR，兼容染料法和探針法，用來檢測高拷貝或低拷貝基因。
Oligo(dT)18 和Random primer (N6)是獨立組分，可以自由選用，以獲得最佳的逆轉錄結果！
引物的選擇：
1. 如果RNA模板來源于真核生物，shou選Oligo (dT)，與真核生物mRNA的3’PolyA尾配對，可獲得最高產量的全長cDNA。
2. 如果對一些物種，不能確定mRNA是否有polyA尾的情況下，shou選Oligo(dT)，不成功再嘗試基因特異性引物(GSP)和Random primer為引物。
3. 基因特異性引物(GSP)的特異性較高。但有些情況下，用于PCR反應的GSP無法有效引導第一鏈cDNA合成，可改用Oligo (dT)或Randomprimer重新進行逆轉錄。
4. Random primer特異性zui低，所有RNA，包括mRNA，rRNA，tRNA均可以作為Random primer的模板。當目標區(qū)域具有復雜二級結構或GC含量較高，或者模板為原核生物來源，使用Oligo (dT)或基因特異性引物(GSP)無法有效引導cDNA合成時，可使用Random primer為引物。
5. 如果合成cDNA下游用于qPCR，可將Oligo (dT)與Random primer混合使用（各加1μl /20μl反應體系），可使mRNA的各個區(qū)域cDNA合成效率相同，有助于提高qPCR結果的真實性和重復性。
第一連 cDNA 合成 (以 20 μl 反應體系為例)
1． 反應體系的配制
操作前，請將各組分輕彈混勻，點甩離心收集至管底，置冰上備用。
使用 RNase-Free PCR 管在冰上配制：
Components | Volume |
Total RNA | 50 ng - 5 μg |
Oligo(dT)18 (0.5 μg /μl) or Random primer (N6) (0.1 μg/μl) or GSP (Gene Specific Primer , 2 pmol/μl) or | 1 μl |
1 μl | |
1 μl | |
5x TRUE Reaction Mix | 4 μl |
dsDNase | 1 μl |
RNase free H2O | To 20 μl |
2．輕柔吸打混勻，點甩離心，置 PCR 儀進行逆轉錄反應。
如用Oligo(dT)18或基因特異性引物(GSP)，產物用于PCR：42℃孵育30 min；產物用于qPCR：42℃孵育15 min。
如用 Random Primer,25℃孵育10 min 后，產物用于 PCR，42℃孵育30 min；
25℃孵育 10 min 后，產物用于 qPCR，42℃孵育 15 min。
注意：如果模板具有復雜二級結構或高 GC 區(qū)域，可以先只加 RNA 模板、 引物和 RNase free H2O，混勻，65℃變性 5 min，冰上冷卻，點甩離心后加入其它成分，并將 42℃孵育溫度提升至 50°C，有助于提高產量。
3． 85°C加熱 5 sec，失活RTase和dsDNase，終止反應。
逆轉錄產物可立即用于PCR或qPCR反應，或保存于-20°C，并在半年內使用；長期存放建議分裝后在-70°C保存，cDNA應避免反復凍融。
PCR
建議取2 - 4 μl的cDNA產物原液作為PCR模板。
1. 常規(guī)擴增：71019-2x Taq PCR MasterMix (30sec/kb)
71800-2x Lightning Taq PCR MasterMix (10sec/kb)
2. 高保真擴增：71812-2x FastHiFi PCR MasterMix (≤3kb片段)
71814-2×LongHiFi PCR MasterMix (≤10kb片段)
qPCR
建議取1~2μl cDNA產物原液作為20μl qPCR反應體系的模板。如果基因表達量較高，請根據(jù)實際情況適當稀釋cDNA模板后使用。
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